HPV (Human Papilloma Virus) - consideratii generale si metode de depistare
Informatii generale si recomandari:
HPV este agentul etiologic responsabil pentru mai mult de 99% dintre toate cazurile de cancer cervical.
HPV este un virus ADN frecvent, transmis prin contact sexual ce cuprinde mai mult de 100 de genotipuri.
Dintre aceste genotipuri, numai 14 sunt considerate ca fiind patogene sau cu risc crescut pentru boli cervicale.
Numeroase studii au evidentiat faptul ca genotipurile 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, si 68 influenteaza avansarea bolii.
Pacientii suferind de o infectie persistenta cu unul dintre aceste tipuri de virus prezinta un risc crescut de dezvoltare a unei displazii grave sau a unui carcinom cervical.
HPV - structura
HPV este un virus relativ mic,dublu catenar.cu capsida sferica
Capsida e formata din doua proteine,proteina structurala L1 si L2
HPV de tipul 6, 11, 42, 43, si 44, care provoaca aparitia unor veruci genitale, sunt considerate ca fiind tipuri cu un risc scazut sau ne-patogene in ceea ce priveste cancerul cervical.
Exista sase gene timpurii (E), doua gene tarzii (L) translatate si o zona lunga de control netranslatata.
Genele timpurii regleaza repicarea virala a HPV.
Proteinele exprimate de ARNm policistronic E6/E7 altereaza functiile celulare ale proteinei 53 si proteinei retinoblastomului conducand la ruperea punctelor de control a ciclului celular si instabilitatea genomului celular.
In prezent, detectia clinica a HPV este efectuata prin analize de diagnosticare in vitro care detecteaza ADN-ul genomic viral, in mod special gena L1.
Totusi, deoarece infectiile cu HPV sunt foarte des intalnite si din cauza faptului ca majoritatea femeilor vor evolua clinic spre vindecare de infectiile cu HPV in decurs de 6 pana la 12 luni , prezenta ADN-ului HPV nu inseamna ca displazia cervicala sau cancerul cervical este prezent.
O abordare mai eficienta pentru detectarea bolilor cervicale este semnalarea acelor elemente oncogene ale HPV-ului care favorizeaza infectiile virale si transformarile celulare.
Proteinele E6 si E7 produse de tipurile HPV cu risc crescut detin un rol esential in carcinogeneza fiind exprimate atat in leziunile cervicale pre-maligne cat si in cele avansate.
Un eveniment crucial pentru transformarea maligna este integrarea ADN circular HPV in genomul gazdei.
Integrarea se produce adesea la nivelul genei E2 care este astfel inactivata; ca urmare a acestui proces rezulta o expresie necontrolata a genelor E6 si E7.
Subtipurile HPV anogenitale se clasifică în:
-subtipul "low risk“ , de exemplu HPV6 şi HPV11 care se asociază cu leziuni scuamoase ce progresează rar în cancer
-subtipul "hight risk“ , HPV16 şi HPV18 ce se asociază cu leziuni neoplazice intraepiteliale sau leziuni scuamoase care pot progresa în cancer.
Sudiile experimentale au dovedit că cele mai multe neoplazii cervicale, intraepiteliale sau invazive sunt datorate infecţiei HPV.
ADN HPV "hight risk" se intalneste in 90% din cancerele umane cervicale.
Tipurile HPV "hight risk" codifică două oncoproteine, E6 si E7.
Oncoproteinele E6 si E7 perturba ciclul celular prin legarea si inactivarea a doua proteine ale gazdei cu rol important in reglarea diviziunii celulare normale: proteina supresoare tumorala p53 si proteina retinoblastomului pRb.
Proteinele E6 si E7 ale diferitelor tipuri HPV exercita un efect variabil in cursul procesului de transformare maligna: cele provenite de la HPV 16 si HPV 18 au un potential oncogen ridicat, pe cand cele produse de HPV 6 si HPV 11 sunt incapabile sa lege si sa inactiveze p53 si pRb.
Integrarea materialului genetic viral in genomul gazdei este insotita de alterarea morfologiei epiteliului scuamos cervical, de la leziuni intraepiteliale cu risc scazut la cele cu risc crescut, caracterizate prin atipii citologice si indice mitotic anormal.
In cazul leziunilor intraepiteliale cu risc scazut (LSIL) nu se constata integrarea ADN-ului HPV, spre deosebire de HSIL in care materialul genetic viral este frecvent integrat in genomul gazdei.
In absenta tratamentului, un numar semnificativ de HSIL evolueaza catre cancer cervical, desi acest proces poate sa dureze ani de zile sau chiar decade.
Pentru a pune in evidenta activitatea oncogena HPV au aparut teste care se bazeaza pe detectarea ARN-ului mesager pentru proteinele E6/E7 din 14 tipuri HPV cu risc crescut.
ARNm E6/E7 traduce activitatea virala directa si corespunde initierii si mentinerii leziunilor pre-canceroase;
Testele bazate pe ARN au valoare predictiva superioara testelor ADN in ceea ce priveste riscul pentru dezvoltarea cancerului cervical.
S-a constatat ca nivelurile ARNm E6/E7 inregistreaza cresteri proportionale cu severitatea leziunilor, astfel ca detectia produsului de transcriptie ar avea o valoare prognostica mai mare si ar putea imbunatati specificitatea si valoarea predictiva pozitiva a ADN-HPV in screening.
Intr-un studiu norvegian 3% din femeile peste 30 ani testate au fost pozitive pentru ARNm E6/E7 iar pentru persoanele cu citologie normala sau modificarile de tip LSIL s-au obtinut mult mai putine rezultate pozitive la testul pentru ARNm decat la detectia HPV-ADN tipuri oncogene.
Valoarea prognostica a acestui test a fost evaluata de asemenea intr-un studiu de urmarire, pe o perioada de 2 ani, a 77 paciente cu citologie ASC-US (“celule scuamoase anormale de semnificatie nedeterminata”) sau LSIL;
Femeile care au obtinut rezultate pozitive la testul ARNm au avut o probabilitate de 70 ori mai mare de a fi diagnosticate cu neoplazie cervicala intraepiteliala CIN 2+confirmata histologic decat femeile cu rezultate negative
Mai mult, testul ARNm a prezentat o sensibilitate clinica pentru CIN 2+ similara cu cea a testelor PCR de detectie ADN-HPV dar o specificitate clinica mai mare, ceea ce sugereaza ca testele bazate pe ARNm ar putea imbunatati triajul pacientelor cu citologie echivoca sau cu risc scazut.
Intr-un studiu care a inclus femei sub 30 ani, rata de pozitivitate pentru ARNm E6/E7 a fost de 14.5% in comparatie cu cea de 32.5% si 20.8% pentru ADN-detectie tipuri oncogene si respectiv genotipare HPV.
Obtinerea unui numar mai mic de rezultate pozitive la testul ARNm se traduce practic intr-un numar mai redus de paciente care trebuie urmarite.
Totusi, testul ARNm ar putea prezenta valoare in cazul femeilor sub 30 ani, mai ales ca la aceste persoane nu se recomanda testarea ADN-HPV datorita prevalentei foarte mari a infectiilor tranzitorii.
Tot intr-un studiu norvegian ARNm E6/E7 a fost pozitiv in 89% din carcinoamele scuamoase ale colului si in 77% din leziunile cu risc crescut (CIN 2/3).
CIN 2+ a fost detectat la 83% din femeile cu citologie normala si ARNm pozitiv.
Nu a fost calculata valoarea predictiva a testului in acest studiu, insa se pare ca specificitatea clinica a ARNm este mai buna fata de cea a ADN-HPV.
S-a raportat ca un singur rezultat ARNm pozitiv are valoare predictiva mai buna pentru infectia persistenta decat testul ADN
Concluzie:
- detectia calitativa a produsului de transcriptie E6-E7 pentru 14 tipuri HPV cu risc crescut poate sa evalueze specific riscul de progresie si de transformare maligna in special la femeile cu citologie ASC-US sau LSIL, precum si la cele cu citologie normala si ADN-HPV pozitiv.
- 60-80% din numeroasele infectii HPV sunt tranzitorii, fiind eliminate spontan, in medie, in decurs de 1 an, ceea ce face ca testul ARNm sa fie mai specific decat detectia ADN-ului viral.
- scopul este deci depistarea infectiilor active si potential persistente.
Pregatirea pacientei
- se va evita recoltarea probei in perioada menstruala.
De asemenea, 48 ore inainte de prelevarea probei, pacientele vor evita:
-raporturile sexuale;
-efectuarea dusurilor vaginale;
-folosirea tampoanelor intravaginale, contraceptivelor locale, a diverselor geluri, creme si tratamente vaginale
Specimen recoltat
-celule cervicale colectate in mediu lichid
-recoltarea va fi efectuata cu ajutorul periutei cervicale Cervex-Brush.
Stabilitate proba
- celulele cervicale colectate in mediul special sunt stabile cel putin 8 saptamani la 2-8ºC.
Metoda
- NASBA (amplificare bazata pe secvente de acizi nucleici).
- testul identifica productia oncoproteinelor E6 si E7 (factor primar in carcinogeneza) si nu virionii HPV; de asemenea specifica genotipul HPV asociat produsului de transcriptie identificat.
Valori de referinta
- Limita de detectie pentru cele 14 tipuri HPV variaza intre 2.3×102 si 3.0×10000 copii/mL.
Interpretarea rezultatelor
- Un rezultat pozitiv pentru HPV E6/E7 ARNm are un alt impact clinic decat cel pentru HPV-ADN in sensul ca indica un potential crescut de transformare maligna a epiteliului scuamos cervical.
Diagnosticul de laborator
Reactia PCR depisteaza ADN-ul viral (regiunea tinta L1 a genomului HPV) prin tehnici de amplificare, confirmand prezenta infectiei la nivelul celulelor cervicale.
Doar 20% din aceste infectii sunt persistente, dintre care 3-10% conduc spre cancer cervical.
Pentru a pune in evidenta activitatea oncogena a HPV s-au dezvoltat teste care se bazeaza pe detectarea ARN-ului mesager pentru proteinele E6, E7.
Infectia cu HPV este necesara dar nu suficienta pentru dezvoltarea leziunilor severe, în timp ce persistenta virusului la nivelul epiteliului este cruciala in procesul de eliminare sau progresie a afectiunii.
Aceasta capacitate de progresie este determinata de expresia necontrolata a oncoproteinelor E6 si E7 ale HPV.
Infectia persistenta cu HR-HPV este cauza recunoscuta a 99,7% din cazurile de cancer cervical.
Motivul pentru care se alege determinarea E6, E7 mARN, este de a exclude acele rezultate pozitive pentru ADN HPV, pentru care sistemul imun al gazdei contribuie la remiterea leziunilor si de a pune in evidenta numai acele leziuni cu risc de malignizare.
De ce detectam E6, E7?
Detectia HPV E6/E7 indica activitatea oncogenica a HPV si nu numai prezenta virusului
Este cel mai important indicator pentru dezvoltarea cancerului cervical si poate fi utilizat ca marker predictiv pentru identificarea acelor femei care prezinta risc de a dezvolta leziuni displazice de grad inalt si cancer.
Testele bazate pe detectarea ADN pot furniza rezultate fals negative (4-25% din cazuri)
Din aceste motive, putem afirma ca HPV E6/E7, este o metoda ideală de screening, avand ca tinta detectia transcriptiei active a proteinelor oncogene ale HPV si expresiei lor.
